500年來(lái)，人們一直對(duì)《蒙娜麗莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的觀(guān)者或在不同的時(shí)間去看，感受似乎都不同。有時(shí)覺(jué)得她笑得舒暢溫柔，有時(shí)又顯得嚴(yán)肅，有時(shí)像是略含哀傷，有時(shí)甚至顯出譏嘲和揶揄。在一幅畫(huà)中，光線(xiàn)的變化不能像在雕塑中產(chǎn)生那樣大的差別。但在蒙娜麗莎的臉上，微暗的陰影時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，為她的雙眼與唇部披上了一層面紗。而人的笑容主要表現(xiàn)在眼角和嘴角上，達(dá)·芬奇卻偏把這些部位畫(huà)得若隱若現(xiàn)，沒(méi)有明確的界線(xiàn)，因此才會(huì)有這令人捉摸不定的“神秘的微笑”。荷蘭阿姆斯特丹的一所大學(xué)應(yīng)用“情感識(shí)別軟件”分析出蒙娜麗莎的微笑包含的內(nèi)容及比例：高興83%，厭惡9%，恐懼6%，憤怒2%。
哈佛大學(xué)神經(jīng)科專(zhuān)家瑪格麗特·利文斯通博士說(shuō)，蒙娜麗莎的微笑時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，是與人體視覺(jué)系統(tǒng)有關(guān)，而不是因?yàn)楫?huà)中人表情神秘莫測(cè)。利文斯通博士是視覺(jué)神經(jīng)活動(dòng)方面的權(quán)威，主要研究眼睛與大腦對(duì)不同對(duì)比和光暗的反應(yīng)。利文斯通說(shuō)：“笑容忽隱忽現(xiàn)，是由于觀(guān)看者改變了眼睛位置。”她表示，人類(lèi)的眼睛內(nèi)有兩個(gè)不同部分接收影像。中央部分(即視網(wǎng)膜上的淺窩)負(fù)責(zé)分辨顏色、細(xì)致印記。環(huán)繞淺窩的外圍部分則留意黑白﹑動(dòng)作和陰影。據(jù)利文斯通說(shuō)，當(dāng)人們看著一張臉時(shí)，眼睛多數(shù)集中注視對(duì)方的雙眼。假如人們的中央視覺(jué)放在蒙娜麗莎的雙眼，較不準(zhǔn)確的外圍視覺(jué)便會(huì)落在她的嘴巴上。由于外圍視覺(jué)并不注重細(xì)微之處，無(wú)形中突出了顴骨部位的陰影。如此一來(lái)，笑容的弧度便顯得更加大了。不過(guò)，當(dāng)眼睛直視蒙娜麗莎的嘴巴，中央視覺(jué)便不會(huì)看到陰影。利文斯通說(shuō)：“如果看著她的嘴巴，便永遠(yuǎn)無(wú)法捕捉她的笑容。”蒙娜麗莎的笑容若隱若現(xiàn)，源于人們的目光不斷轉(zhuǎn)移。利文斯通指出，若要臨摹《蒙娜麗莎》，描繪口部時(shí)便要望著別處。
1993年，加拿大美術(shù)史家蘇珊·吉魯公布了一項(xiàng)令人震驚的研究成果。她說(shuō)蒙娜麗莎那傾倒無(wú)數(shù)觀(guān)賞者的口唇，是一個(gè)男子裸露的脊背。這一論斷既新鮮又荒誕，然而論證是有力的。集畫(huà)家、雕刻家、建筑師、工程師及科學(xué)家等多種才藝于一身的達(dá)·芬奇，可謂是個(gè)“怪杰”。他喜歡穿粉紅色外套，在胡須上毫無(wú)顧忌地涂上五顏六色，還常稱(chēng)自己解剖過(guò)不下30具死尸。他還是個(gè)左撇子，習(xí)慣從右到左倒著書(shū)寫(xiě)，別人要借助鏡子才能讀出他寫(xiě)的東西。因此借助鏡子亦不失為欣賞者讀畫(huà)的一種方法。旋轉(zhuǎn)90度后從鏡中看蒙娜麗莎抿著的笑唇，恰好是一個(gè)背部線(xiàn)條分明的結(jié)實(shí)男性脊背以及左臂和肘部的一角；再說(shuō)，表現(xiàn)人體美和呼喚人性的覺(jué)醒，既是大師的人生哲學(xué)，又是他的藝術(shù)觀(guān)。
確實(shí)，在不同角度不同光線(xiàn)下欣賞這幅畫(huà)，人們都會(huì)得到不同的感受。那微笑時(shí)而溫文爾雅，時(shí)而安詳嚴(yán)肅，時(shí)而略帶哀傷，時(shí)而又有幾分諷嘲與揶揄，神秘莫測(cè)的微笑顯露出人物神秘莫測(cè)的心靈活動(dòng)。
幾百年來(lái)，“微笑”的新解層出不窮。諸如微笑不露皓齒是因原型雖典雅美麗卻口齒不齊；原 專(zhuān)家揭秘蒙娜麗莎隱藏四種動(dòng)物型因愛(ài)女夭折，憂(yōu)郁寡歡，難掩凄楚之態(tài)；更有甚者，把蒙娜麗莎從貴婦寶座上推落下來(lái)，把原型貶為妓女，故而微笑中帶著譏嘲和揶揄。
美國(guó)馬里蘭州的約瑟夫·鮑考夫斯基博士認(rèn)為：“蒙娜麗莎壓根就沒(méi)笑，她的面部表情很典型地說(shuō)明她想掩飾自己沒(méi)長(zhǎng)門(mén)牙。”
法國(guó)里昂的腦外科專(zhuān)家讓·雅克·孔代特博士認(rèn)為蒙娜麗莎剛得過(guò)一次中風(fēng)，請(qǐng)看，她半個(gè)臉的肌肉是松弛的，臉歪著所以才顯得微笑。
英國(guó)醫(yī)生肯尼思·基友博士相信蒙娜麗莎懷孕了。他的根據(jù)是：她的臉上流露出滿(mǎn)意的表情，皮膚鮮嫩，雙手交叉著放在腹部。性學(xué)專(zhuān)家推測(cè)：蒙娜麗莎剛剛經(jīng)歷了性高潮，所以才表現(xiàn)出令世人傾倒的微笑。